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邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯及氯氰菊酯致大鼠性腺发育障碍的研究

发表于：2015-3-5 作者：管理员访问次数：2564次

邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯及氯氰菊酯致大鼠性腺发育障碍的研究

高连连蔡德培

复旦大学附属儿科医院，上海，200032

【摘要】目的探讨邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-2-ethylhexylphthalate，DEHP）和氯氰菊酯（Cypermethrin，CYP）单独及联合染毒引致青春前期雄性大鼠性腺发育不良的作用机制。方法 SPF级3周龄雄性SD大鼠40只，随机分为对照组(玉米油)、DEHP单独染毒组（500 mg/kg）、CYP单独染毒组（80 mg/kg）及联合染毒组（DEH 500mg/kg+CYP 80mg/kg ），各组10只，经口灌胃连续染毒30天，每天1次。于末次染毒24小时后处死动物，测大鼠体重及睾丸湿重，并计算睾丸系数；光镜观察睾丸组织改变，电镜观察生殖细胞超微结构变化；实时荧光定量PCR法测定雄激素结合蛋白(ABP)、抑制素(INHB)、卵泡刺激素受体(FSHR)、波形蛋白(VIM)、过氧化物增殖受体 γ（PPARγ）mRNA的相对表达变化。结果与对照组相比，DEHP、CYP单独及联合染毒组睾丸重量及睾丸系数明显降低，各染毒组睾丸病理组织学及生殖细胞超微结构可见明显病变，DEHP单独及联合染毒组中睾丸支持细胞INH B、ABP、VIM 基因的表达水平显著下降（p <0.05或p<0.01），CYP单独染毒组ABP、VIM的基因表达亦明显下降（p<0.05），各染毒组PPARγ 基因表达水平均显著上升（p<0.05）；与DEHP、CYP单独染毒组相比，联合染毒组VIM、 PPARγmRNA的表达水平差异显著，交互作用有统计学意义（p<0.05），VIM表现为协同效应，PPARγ表现为拮抗效应。结论 DEHP、CYP单独及联合染毒均可致青春前期大鼠性腺发育不良，二者均可不同程度的干扰睾丸支持细胞相关的基因与蛋白的表达，联合染毒呈一定拮抗作用，两者相比，以DEHP的生殖毒性更强。

关键词邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯；氯氰菊酯；睾丸；支持细胞

Mechanism of Di-2-Ethylhexyl Phthalate, Cypermethrin and Combined Exposure on Fertility and Development of the Prepubertal Male Rats

Gao Lian-lian,Cai De-pei. Research department of Integrated Traditional and Western Medicine, Childrens Hospital of Fudan University, Shanghai 200032, China

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基金项目：国家自然科学基金(30371820)

作者单位：200032 上海，复旦大学附属儿科医院中西医结合科

通信作者：蔡德培，E-mail：dp_cai@yahoo.com.cn

Abstract: Objective To investigate the separate and combined toxic effects and mechanism of di-2-ethylhexylphthalate (DEHP) and Cypermethrin(CYP) on reproductive system of prepubertal male rats. Methods A total of 40 healthy 3-week-old SPF male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups. each group consists of 10 rats. They were control group(corn oil), DEHP group(500 mg/kg, dissolved in corn oil), CYP group(80mg/kg, dissolved in corn oil), combine group(500mg/kg DEHP + CYP 80mg/kg, dissolved in corn oil), respectively, which were exposed consecutively for 30 days to DEHP or CYP by the means of gavage administration. After the exposure, the testis were weighted and testis coefficient was calculated, histopathological changes of the testis was examined by light microscopy and transmission election microscopy. The relative mRNA expressions of androgen binding protein(ABP), inhibin beta-B(INHB), follicle stimulating hormone receptor(FSHR), vimentin(VIM) and peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ) were analyzed by real time quantitative RT-PCR. Results Compared with control group, the wet weight of testis and testis coefficient were significantly decreased in DEHP, CYP and combined group. Histologic structure and ultrastructure of testis showed obvious abnormalities in each exposure group. The level of ABP, INHB and VIM were significantly lower in DEHP and combined group, and the level of ABP, VIM were a significant decrease in CYP group, while PPARγ was significantly increase in each exposure group. Compared with single group, the interactive influence on the level of VIM and PPARγ was statistically significant in combined group, which the VIM showed synergistic effects, while PPARγ showed antagonistic effect. Conclusions Data suggest that DEHP and CYP had obviously separate and combined reproductive toxicity to prepubertal male rats, which they could significantly impair seminiferous epithelium，sertoli cells and cytoskeletal structure of sertoli cells. Both of them could disturb the expression of Sertoli cell -related genes and PPARγ gene, Which DEHP had direct toxic effects on Sertoli cell, while the reproductive toxicity of CYP may through impairment of the cytoskeletal structure of sertoli cells, and interference of energy and signal transduction between sertoli cells and spermatogenic cells

Key words：Di-(2-ethylhexyl) phthalate； Cypermethrin；Fertility；Testis；Sertoli cells

邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-2-ethylhexylphthalate，DEHP）是邻苯二甲酸酯类化合物最重要的增塑剂，每年生产量高达1~400万吨，被广泛应用于食品包装、儿童玩具、医疗用品等制造行业。^[1]DEHP在肝脏中可迅速代谢为毒性更强的邻苯二甲酸单-2-乙基己酯(mono-2-ethylhexyl phthalate，MEHP)。^[2]大量研究显示，DEHP/MEHP具有明显的生殖毒性，尤以男性（雄性）生殖毒性为显著，可致青春延迟，睾丸萎缩，隐睾，精子数量与质量下降等。^[3-5]氯氰菊酯（Cypermethrin，CYP）是在我国被广泛使用的Ⅱ型拟除虫菊酯类农药，具有很高的胃毒性和触杀作用，主要应用于农业害虫、卫生害虫及贮粮害虫等的防治。Elbetieha^[6]等实验显示CYP可致人及动物一系列的生殖障碍，如雄鼠不育，雌鼠产仔量减少等。环境化合物在真实环境中常常联合作用于生物体，可经由不同的毒理作用机制显示出一种剂量增加性的累积效应。Rider^[7]等报道，经邻苯二甲酸丁苄酯，烯菌酮及利谷隆等七种抗雄激素化物联合处理的孕鼠，其子代出现明显的尿道下裂和附睾发育不全等生殖器官畸形，并呈剂量增加性的累积效应。目前，DEHP及CYP的抗雄激素生殖毒性的作用机制尚不是很清楚。DEHP主要作用于支持细胞，亦可抑制间质细胞睾酮的合成，可藉多种机制诱导其生殖毒性。^[8]CYP的研究主要集中在抗氧化损伤和自由基的激活。^[9]前期本课题组已证实DEHP、CYP单独及联合染毒有明显的雄性生殖毒性，并通过检测睾丸标志酶，睾酮合成关键酶的基因与蛋白表达水平初步探讨其雄性生殖毒性的作用机制。^[10]支持细胞对生精细胞具有营养、支持、保护作用，受卵泡刺激素 (Follicle stimulating hormone，FSH)的调控，且是唯一表达卵泡刺激素受体（follicle stimulating hormone receptor，FSHR）的细胞，还分泌雄激素结合蛋白(androgen binding protein，ABP)，抑制素（inhibin INH）等蛋白质参与生精过程，波形蛋白（vimentin，VIM）是支持细胞骨架的重要成分，过氧化物增殖受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR γ）与细胞分化及凋亡密切相关，任何破坏支持细胞骨架结构与功能的物质均能干扰生精过程，进而导致生殖系统的异常。既往国内外的研究主要集中在胚胎期和新生期，对青春期研究较少。为此，本实验研究了青春前期DEHP、CYP单独及联合染毒对雄性SD大鼠生殖系统结构和功能的影响，并通过检测睾丸支持细胞相关基因及PPARγ 基因的表达进一步探讨其可能作用机制。（`c±s）

材料与方法

1 材料

1.1 实验动物：21日龄雄性SPF级SD大鼠40只（体重58.5±4.3g），购自上海西普尔必凯实验动物有限公司（许可证号：SCXK（沪）2008-0016）。动物饲养于屏障系统中，温度为22±2℃，相对湿度为45%~55%，光照条件为12h光照与12h黑暗交替。大鼠自由饮水。

1.2 染毒物质：DEHP：分析纯，纯度>=99%，上海劲马实验设备有限公司，（生产批号：5548）；CYP：有效成分>95%，南京荣诚化工有限公司，（生产批号：0696）。

1.3 主要试剂及仪器：玉米油：市售，金龙鱼牌；RNA提取试剂盒TRIZOL：Invitrogen公司；SYBR®Premix Ex TaqTM：宝生物工程有限公司；PrimeScript®RT Master Mix（Perfect Real Time）：宝生物工程有限公司。UNICO UV-2000型分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；Olympus BH2型显微镜；Panasonic MV-C P410型摄像机；实时荧光定量PCR扩增仪（Mastercycler ep realplex）：eppendorf公司。

2 方法

2.1 染毒剂量及时间的确定

根据本课题前期预实验通过对睾丸发育指标、血清激素水平及睾丸组织病理学的观察，确定正式实验的最佳染毒剂量 DEHP 500mg/kg、CYP 80mg/kg，染毒时间30天。

2.2 实验动物分组及染毒

40只SD雄性大鼠随机分成4组，每组10只。对照组(玉米油)、DEHP染毒组（DEHP 500 mg/kg）、CYP染毒组（CYP 80 mg/kg）、联合染毒组（DEHP 500mg/kg+CYP 80m/kg）。每天灌胃一次，给药期间每天称重，根据体重调整给药量。连续染毒30天。

2.3睾丸湿重及组织病理学检查

末次给药24小时后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速剥离双侧睾丸，立即称重，并计算脏器系数。取一侧睾丸的一半于10%中性福尔马林固定24h后，石蜡包埋，连续切片，片厚5μm，常规HE染色后镜检；另一半睾丸迅速投入4%多聚甲醛—2%戊二醛（pH7.4）混合固定缓冲液中，预固定5 min～10 min。待柔软组织稍变硬后，用刀片快速分切成1 cm×1 cm×1 cm大小的组织块，然后室温继续固定2小时，电镜标本常规脱水，包埋，超薄切片，行醋酸铀、枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察。电镜标本由复旦大学上海医学院电镜室制作。另一侧睾丸迅速投入液氮并于-80℃保存用于抽提RNA。

2.4 实时荧光定量PCR检测 INH B、ABP、VIM、FSHR、PPARγmRNA的表达量

2.4.1 总RNA的提取及cDNA的合成

取50~100mg睾丸组织，Trizol法提取组织中总RNA，具体操作严格按照说明书进行。取吸光度A260/A280值为1.8~2.0的RNA作为模板进行逆转录。根据RNA的浓度计算模板RNA的用量，10 μl体系最大用量500ng。

2.4.2 引物设计与合成

各引物均由生工生物公司设计及合成，经blast比对确定其特异性。引物合成后经普通PCR及琼脂糖凝胶电泳确定其特异性与产物大小。

各引物序列见表1.

表1

基因与引物名称		引物序列(5to3)	产物大小(bp)
NM_031144	Actin beta_F	cacccgcgagtacaaccttc	207
	Actin beta_R	cccatacccaccatcacacc
NM_012650.1	Abp_F	tcggcttacagtaggct	107
	Abp_F	cttttccatccacccatag
NM_080771.1	Inhbb_F	gtctctaacgaaggcaaccag	214
	Inhbb_R	cctctgtaatggggaaggtatg
NM_031140.1	Vim_F	aggcaaagcaggagtcaaac	115
	Vim_R	tcttccatttcacgcatctg
NM_199237.1	Fshr-F	acatccataccaagagccagta	226
	Fshr-R	gcaaaagtccagcccaatac
NM_001145366.1	Pparg_F	cctccctgatgaataaagatgg	121
	Pparg_R	gcaaactcaaacttaggctcca

2.4.3 实时荧光定量PCR法检测

RNA总提取及cDNA合成后，在其他条件不变的情况下，分别对退火温度，引物浓度等进行优化。Real-time PCR反应体系25 μl，体系含（1）SYBR®Premix Ex Taq^TM12.5μl（2）模板2μl（3）上下游引物各0.5 μl（4）灭菌水9.5μl。三步法进行PCR扩增，各引物的退火温度分别是：β-actin 60℃，ABP 60 ℃，INH B58℃，FSHR 58 ℃，PPARγ 58.2℃VIM 57.4℃，40个循环后绘制溶解曲线，确保PCR的特异性。每个样品的β-actin和目的基因分管，每管设3个平行样，并在相同条件下扩增。余操作严格按照说明书进行。

根据real-time PCR相对定量2^—^△△^CT方法，计算目的基因的表达量。

2.5 统计分析

所有数据以均值±标准差（`c±s）表示，实验结果采用SPSS20.0统计分析软件进行2×2析因方差分析。两两比较采用LSD检验，方差不齐时用Tamhane检验。 p<0.05，为差异显著；p<0.01，为差异非常显著。

结果

1一般状况及体重变化

染毒期间，各组大鼠饮食活动正常，无明显的毒性作用。各染毒组大鼠体重均值较对照组有所降低，但差异无统计学意义（P>0.05）。与CYP、DEHP单独染毒组相比，DEHP、CYP联合染毒对大鼠体重的影响无明显交互作用（P>0.05）。

表1 DEHP、CYP单独及联合染毒对大鼠睾丸体重的影响（n=10， ±s）

Table 1 the single and combined toxic effects of DEHP and CYP on the body weight gain of rats. （ ±s）

组别动物数/只体重增长量/g

对照组 10 189.12±8.51

DEHP染毒组 10 179.12±3.32

CYP染毒组 10 181.20±3.26

DEHP+CYP联合染毒组 10 183.22±4.32

注：经2×2 析因方差分析，P>0.05。

2 各组睾丸湿重及脏器系数的比较

由表2可见：与对照组相比，各染毒组睾丸重量、睾丸系数均显著降低（p<0.05或p<0.01），与DEHP、CYP单独染毒组相比，联合染毒睾丸重量及睾丸系数差异无统计学意义（P>0.05），

表2 DEHP、CYP单独及联合染毒对大鼠睾丸重量及系数的影响（n=10， ±s）

Table 2 the single and combined toxic effects of DEHP and CYP on the testicular weight and testis coefficient （ ±s）

组别睾丸脏器

重量/g 系数/%

对照组 1.96±0.31 0.82±0.07

DEHP染毒组 0.88±0.07^## 0.40±0.11^##

CYP染毒组 1.15±0.24^# 0.59±0.13^#

DEHP+CYP染毒组 1.01±0.18^# 0.56±0.10 ^##

注：经2×2 析因方差分析，^* P<0.05，^** P<0.01。与对照组比较，^# P<0.05，^## P<0.01。

3 睾丸组织病理学变化

由图1可见，对照组精曲小管内生精细胞排列整齐，层次清楚，结构正常，管内可见各级生精细胞；睾丸支持细胞形态正常，镶嵌于基膜及生精细胞之间；间质细胞成群分布于精曲小管之间，为间质细胞、巨噬细胞等小三角形疏松结缔组织（见图A1、A2）。DEHP单独染毒组出现明显的病理改变，睾丸精曲小管外形不规则、萎缩、变性、坏死，各级生精细胞减少或消失，核固缩，生精细胞上皮退化、变性甚至消失，管腔内未见成熟精子；支持细胞骨架破坏，数量明显减少，仅基底部少量支持细胞，且出现大量空泡；间质增生水肿，汇聚成团，细胞皱缩。 (见图B1、B2)。CYP单独染毒组仅有部分曲细精管受损，生精细胞层数减少，精子细胞、精子数明显减少；支持细胞数量减少，排列紊乱；间质增宽，胞浆嗜酸性增强，核致密深染（见图C1、C2）。DEHP、CYP联合染毒组可见部分曲细精管萎缩变形，萎缩曲细精管的生精上皮变薄，层次减少，部分生精细胞变性、水肿、坏死，细胞数量减少且排列疏松紊乱，管腔内多见脱落及凋亡细胞，未见成熟精子；间质细胞增生水肿；

支持细胞数量减少，骨架破坏，细胞内出现大量空泡（见图D1、D2）。

图1 各组大鼠睾丸光镜检查结果

Figure 1 Morphological altermation of rats testis detected by light microscopy

A1对照组（HE ×200） B1 DEHP染毒组（HE ×200） C1 CYP染毒组（HE ×200） D1 联合染毒组（HE ×200）

A2 对照组（HE ×400） B2 DEHP染毒组（HE ×400） C2 CYP染毒组（HE ×400） D2 联合染毒组（HE ×400）

2 睾丸超微结构的变化

图2 各组大鼠睾丸电镜检查结果

Figure Morphological altermation of rats testis detected by electron microscope

电镜下观察：对照组生精上皮基膜完整，有支持细胞和各级处于不同时期的生精细胞，包括精原细胞，初级精母细胞及精子细胞（图a1，a2）；支持细胞形态正常，核呈椭圆形，核仁显著，嵌于基膜及各级生精细胞之间，高倍下可见生精细胞与支持细胞间或相邻支持细胞间形成紧密连接，支持细胞内含丰富的内质网和线粒体(图a3)。

DEHP单独染毒组可见睾丸生精上皮大量消失，生精细胞数量锐减，未见成熟精子，线粒体嵴消失（见图b1）；部分基膜剥脱、断裂()；精母细胞紧靠基膜，支持细胞与基膜间隙显著增宽（）(图b2)；支持细胞核呈脑模样畸形，基膜外可见凋亡小体（）、精子细胞（图b3）。

CYP单独染毒组可见部分生精上皮消失，精原细胞空泡化，精母细胞坏死，染色质溶解（图c1）；支持细胞肿胀，溶酶体增多，细胞间隙局部增宽，部分线粒体肿胀伴空泡化，粗面内质网扩张，胞内可见凋亡小体（）（图c2、c3）。

DEHP、CYP联合染毒组可见大量生精细胞消失，管内有大量细胞碎片，未见成熟精子（图d1）；支持细胞骨架结构塌陷，核畸形（），部分细胞消失，紧密连接间隙增宽，少量精母细胞及精子细胞移至基膜处，线粒体肿胀，溶酶体增多，胞内见数个大小不等的凋亡小体（）（图d2，d3)。

3 睾丸内ABP、INHB、FSHR、VIM、PPARγ基因的表达情况

由表3结果可见，与对照组相比，DEHP单独及联合染毒组，ABP 、INH B、VIM的基因表达水平显著降低(p<0.05或0.01)， CYP单独染毒组ABP、VIM基因表达明显下降（p<0.05），各染毒组PPARγ基因表达均显著上调（p<0.05）。与CYP、DEHP单独染毒组相比，DEHP、CYP联合染毒组VIM、 PPARγ基因的表达水平差异显著，交互作用有统计学意义（p<0.05），VIM表现为协同效应，PPARγ表现为拮抗效应；ABP、INH B的基因表达水平交互作用无统计学意义（p>0.05）。各组FSHR的基因表达量无显著差异。

表3 各组大鼠睾丸ABP、INH B、FSHR、VIM、PPARγ基因表达水平比较（ ±s）

	ABP	INH B	FSHR	VIM	PPARγ
对照组	1.02+0.06	1.01±0.07	1.01±0.16	1.00±0.08	1.00±0.11
染毒A组	0.39±0.13^##	0.46±0.13^#	0.79±0.14	0.56±0.13^#	2.14±0.34 ^**^#^#
染毒B组	0.60±0.10^#	0.89±0.15	1.00±0.17	0.71±0.11^#	1.78±0.11 ^*^#
染毒C组	0.58±0.11^#	0.56±0.21^#	0.75±0.15	0.45±0.08*^#	1.33±0.09 ^*

注：经2×2 析因方差分析，^* P<0.05，^** P<0.01。与对照组比较，^# P<0.05，^## P<0.01。

讨论

DEHP、CYP是目前研究较为广泛的雄性生殖毒物，环境暴露水平高。青春期是性发育的关键时期，极微量的环境毒物在短时间内就可能引起生殖系统的严重损害，目前对青春期哺乳动物接触环境内分泌干扰物致生殖系统损害方面的研究较少，因此本实验主要就这一方面进行研究。

本研究结果显示，DEHP、CYP单独及联合染毒对青春前期雄性大鼠性腺发育有显著不良影响，可致睾丸重量及脏器系数降低，睾丸组织及超微结构发生显著病变，并可明显干扰睾丸支持细胞相关基因及PPARγ的基因表达。

睾丸是环境毒物作用的主要靶器官。光镜与电镜结果显示各染毒组睾丸均发生了不同程度的组织病变和超微结构的损害，损伤部位主要在生精细胞及支持细胞，支持细胞骨架破坏严重；超微结构显示生精上皮大量消失，细胞数量锐减，并可见凋亡小体；细胞器损害严重，尤以线粒体为主。说明DEHP、CYP单独及联合染毒可明显损害生殖细胞超微结构，破坏支持细胞骨架结构，诱导细胞凋亡进而引起性腺发育不良。其中，DEHP单独染毒组睾丸病变最为明显，其次为联合染毒组。

生理状态下，睾丸支持细胞对生精细胞具有营养、支持及保护等多种作用，是血睾屏障的成分之一，还分泌多种蛋白质参与生精过程，相邻细胞间形成紧密连接参与形成血睾屏障。支持细胞的结构和功能对雄（男）性生殖起着决定作用，其功能状态和数量的多少决定睾丸的大小及精子发生能否正常进行

支持细胞依赖卵泡刺激素 (Follicle stimulating hormone，FSH)发挥生理效应，分泌ABP、INH，转铁蛋白等。ABP可以结合、运输和浓缩雄激素，以维持曲细精管内雄激素的含量，为生精上皮摄入利用；还可随着睾丸网液流入附睾，为精子在附睾内成熟提供保证。本研究结果显示，与对照组相比，DEHP、CYP单独及联合染毒组ABP 浓度均降低。ABP浓度的降低可引起转运至生精细胞以及附睾中雄激素减少，造成生精过程的障碍，说明DEHP、CYP单独及联合染毒可通过干扰支持细胞ABP基因的表达发挥其生殖毒性。INH在体内有INH A和INH B两种形式，雄性睾丸中主要为INH B。抑制素可以反馈性抑制 FSH的合成及分泌，调节精子的发生与分化。Walton MJ ^[11] 等研究发现INH B水平与精子发生保持同步，其水平反映了整个睾丸组织功能。Guitton ^[12] 等曾指出，不仅支持细胞分泌的INH可调节生精细胞，各阶段的生精细胞对支持细胞分泌INH也有调节作用。INH的调节是一个复杂的双向过程，无论INH的表达是增加还是降低，都将干扰精子的正常发生、成熟。本研究中DEHP单独染毒及联合染毒组INH B表达明显降低，说明DEHP可藉干扰INH B mRNA的表达影响生殖系统的异常发育。CYP单独染毒组INH B无明显差别，推测可能是因为DEHP与CYP生殖毒性作用机制有所不同，且INH B复杂的双向调节也是其重要原因之一。FSH通过与细胞膜上FSHR特异性结合促进支持细胞和生精细胞增殖，在精子发生、成熟过程中起着重要作用，支持细胞是睾丸内唯一含有FSHR的细胞，外源化合物可通过影响FSHR的表达影响FSH调节生精过程。本研究各染毒组FSHR mRNA的表达均无显著差异。DEHP单独及联合染毒组中INH B的降低并未反馈性的刺激FSH的表达上升进而引起FSHR的表达上升，可能是因为DEHP对支持细胞的直接毒性作用，使支持细胞对FSH的反应性降低，或者是FSH与受体的结合力(率)降低，但最终都破坏了INH与FSH的反馈与负反馈平衡，进而干扰生精过程。具体机制仍需进一步研究。

VIM是睾丸支持细胞骨架中重要成分，在雄性精子运动细胞信号转导，支持细胞与生精细胞黏附及细胞凋亡中起着重要的作用。已有许多研究证实，外源化学物可以使睾丸支持细胞中VIM分布、形态及数量发生异常，蛋白表达降低甚至消失。^[13]本研究结果显示，各染毒组均降低了VIM的基因表达。VIM表达的降低，可明显改变支持细胞的骨架结构，降低支持细胞对生精细胞营养、支持、保护能力，干扰了支持细胞与生精细胞间的能量信号转导等，进而引致生精障碍。本课题前期对睾丸能量代谢酶LDH、ACP、ALP及SDH检测也证实了DEHP、CYP抗雄激素生殖毒性与其能量代谢异常有关。^[10]光镜与电镜结果也证实DEHP、CYP可明显损害支持骨架结构，破坏细胞间连接，并可引起线粒体肿胀。说明DEHP、CYP单独及联合染毒均可破坏支持细胞的骨架结构，干扰细胞间的能量与信号转导，引起代谢障碍等发挥其抗雄激素生殖毒性，且联合染毒对VIM的mRNA表达具有协同作用。

过氧化物增殖受体γ（PPAR γ）是调节细胞分化和脂代谢的重要转录因子，PPARγ过表达可以引起细胞的凋亡。DEHP属于脂质过氧化物增殖激活剂，可以活化PPAR γ的基因表达，研究提示DEHP/MEHP 通过活化PPAR γ 基因诱导精母细胞的过度凋亡^[14]。本研究DEHP染毒组 PPARγ显著上调（p<0.01），与文献结果一致，结合光镜及电镜结果，证实DEHP对青春前期雄性大鼠的生殖毒性与PPARγ密切相关。Takeuchi，S等^[15]研究表明拟除虫菊酯类农药非PPARγ激活剂，不能直接激活PPARγ的基因表达。本研究中CYP单独染毒中 PPAR γ基因表达也显著上升，推测可能是CYP诱导的抗氧化应激损伤及自由基的激活引起 PPARγ表达上调，一些研究提示PPAR γ具有抗氧化应激能力，氧化应激引起的细胞氧化还原状态的改变可激活丝裂原化蛋白激酶及PPARγ的活性^[16]。超微结构显示线粒体损害显著，也证实CYP雄性生殖毒性与氧化应激有关。与DEHP、CYP单独染毒组相比，联合染毒组PPAR γ的表达显著下调，交互作用有统计学意义，表现为拮抗效应。这也说明二者在诱导PPARγ表达上调机制上可能有所不同，也进而说明DEHP、CYP诱导的青春前期大鼠生殖毒性的作用机制有所差异。

综上所述，DEHP、CYP单独及联合染毒具有明显的雄性生殖毒性，可损害生精细胞及支持细胞，破坏细胞间的连接。二者均可干扰睾丸支持细胞相关基因及PPAR γ的基因表达，其中DEHP对睾丸支持细胞有直接毒性作用，可显著降低支持细胞INH、ABP、VIM的基因表达，活化PPARγ基因，进而破坏其细胞骨架结构，诱导细胞凋亡；CYP可显著降低ABP 、VIM基因表达，破坏细胞间的连接，干扰支持细胞与生精细胞间能量信号转导。二者最终都可引起生殖细胞的损伤、凋亡，干扰精子的发生、分化与成熟，进而引起雄性生殖系统发育和功能的显著异常。

参考文献

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本文已发表于中华劳动卫生职业病杂志2014；32（3）：195～201